Measles virus RNA Real-Time PCR Protocol
【RNA抽出】
使用する試薬
RNA Extraction buffer (5.5M guanidine thiocyanate, 25mM tri-sodium citrate, 0.5% N-Lauroylsarcosine sodium salt, 1.0% 2-Mercaptoethanol, 0.0125% carboxymethyl cellulose; sodium salt, medium viscosity)
20mg/mL ProteinaseK Solution (20mg/mL ProteinaseK in 10mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM Calcium Chloride, and 50% Glycerol)
isopropanol
PCR inhibitor removal buffer (50% isopropanol, 40% RNA Extraction buffer eliminated carboxymethyl cellulose)
70% Ethanol
RNase free water
抽出方法
○ 血清は200μLを使用する。
○ 咽頭ぬぐい液は500μLのRNase free waterに懸濁後、200μLを使用する。
1.5mLマイクロチューブに20mg/mL ProteinaseK Solutionを40μL分注。
検体200μLを加える。200μLフィルターチップ使用。
RNA Extraction buffer 400μLを加える。
ボルテックスによりよく混ぜる。
56℃ 15分間インキュベートする。
スピンダウンして蓋に付いた溶液を落とす。
isopropanol 600μLを加える。
15回ほど転倒混和してよく混ぜる。ボルテックスを行ってはならない。
4℃ 14,000rpm 10分間遠心。
ペレットを吸い上げないように注意して上清を廃棄する。1000μLフィルター チップ使用。50μL程の溶液が残っていても構わない。
PCR inhibitor removal buffer 1000μLを加える。
指でタッピングしてペレットを剥がし、3回ほど転倒混和してよく混ぜる。
4℃ 14,000rpm 1分間遠心。
ペレットを吸い上げないように注意して上清を廃棄する。1000μLフィルター チップ使用。50μL程の溶液が残っていても構わない。
70% Ethanol 1000μLを加える。
指でタッピングしてペレットを剥がし、3回ほど転倒混和してよく混ぜる。
4℃ 14,000rpm 1分間遠心。
ペレットを吸い上げないように注意して上清を廃棄する。1000μLフィルター チップ使用。50μL程の溶液が残っていても構わない。
スピンダウンして溶液を集め、100μLフィルターチップを使用して上清を完全に廃棄する。
2分ほど軽く風乾する。
RNase free water 100μL加えてボルテックスによりよく混ぜる。
抽出したRNAはすぐに逆転写反応を行う。残ったRNAは-80℃で保存する。
【逆転写反応】
使用する装置
GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)
使用する試薬
The PrimescriptTM RT reagent Kit (TaKaRa BIO INC. Kyoto, Japan)
逆転写反応
抽出したRNA 5μLを用いて逆転写反応を行う。
反応液量は10μL、下記に1sample当たりのマスターMIX組成を記す。
検体数+2（陰性コントロールのH2Oを必ず入れること）sample分MIXを作成する。
操作は全てフィルターチップを使用すること。
試薬名 | 添加量 |
5×PrimeScriptTM Buffer | 2.0μL |
Random 6mers | 0.5μL |
PrimeScriptTM Enzyme Mix 1 | 0.5μL |
RNase Free dH2O | 2.0μL |
マスターMIXはピペッティングで混ぜる事。ボルテックスを行ってはならない。
調整したマスターMIXをPCRチューブに5μLずつ分注し、抽出したRNA 5μLを加える。キャップを閉めてスピンダウンする。
GeneAmp PCR System 9700にセットして、下記の温度条件で逆転写反応を行う。
25℃ 10分間（Random 6mersのアニーリング）
42℃ 15分間（逆転写反応）
85℃ 5秒間 （逆転写を熱失活させる）
4℃
【リアルタイムPCR】
使用する装置
LightCycler ST-300 (Roche Diagnostics, Indianapolis, U.S.A.)
使用する試薬
SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa BIO INC. Kyoto, Japan)
リアルタイムPCR
合成したcDNA（またはH2O）10μLにRNase free water 15μL加えてピペッティングで混ぜる（溶液はPCRチューブに入っているので）。100μLフィルターチップを使用すること。この2.5倍希釈したcDNA（またはH2O）5μLをリアルタイムPCRに使用する。
反応液量は20μL、下記に1sample当たりのマスターMIX組成を記す。
検体数+1sample分MIXを作成する。
試薬名 | 添加量 |
2×SYBR Premix Ex TaqTM | 10μL |
10μM Primer Mix (*) | 1.0μL |
RNase Free dH2O | 4.0μL |
*MV-NP1: CCTCAATTACCACTCGATCC（235-254）
MV-NP4: TTGATGCGAAGGTAAGGCCA（462-443）
上記のPrimer MIX。Nucleoprotein領域の228bpを増幅させる。
Primer PositionはGene bank accession number: #AB016162参照した。
マスターMIXはピペッティングで混ぜる事。ボルテックスを行ってはならない。
調整したマスターMIXをガラスキャピラリーに15μLずつ分注し、2.5倍希釈したcDNA（またはH2O）5μLを加える。キャップを閉めてスピンダウンする。
LightCycler ST-300にセットして、下記の温度条件でリアルタイムPCRを行う。
Denature
Cycle Program DATA | Value |
Cycles | 1 |
Analysis Mode | None |
Temperature Targets | Segment 1 |
Target Temperature (℃) | 95 |
Incubation time (S) | 30 |
Temp. Transition Rate (℃/S) | 20.0 |
Acquisition Mode | None |
PCR
Cycle Program DATA | Value | ||
Cycles | 45 | ||
Analysis Mode | Quantification | ||
Temperature Targets | Segment 1 | Segment 2 | Segment 3 |
Target Temperature (℃) | 95 | 64 | 72 |
Incubation time (S) | 5 | 10 | 10 |
Temp. Transition Rate (℃/S) | 20.0 | 20.0 | 20.0 |
Acquisition Mode | None | None | single |
Melting
Cycle Program DATA | Value | ||
Cycles | 1 | ||
Analysis Mode | Melting curve | ||
Temperature Targets | Segment 1 | Segment 2 | Segment 3 |
Target Temperature (℃) | 95 | 65 | 95 |
Incubation time (S) | 0 | 15 | 0 |
Temp. Transition Rate (℃/S) | 20.0 | 20.0 | 0.2 |
Acquisition Mode | None | None | continuous |
【データー解析に関して】
少なくともPrimer dimmerが出現しない事を確認している。増幅曲線が得られ、かつ融解温度がシングルで認められたときに陽性と判断する。
さしあたっては2%アガロースゲル電気泳動を併用する。