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根粒菌の共生的窒素固定

新・土の微生物(2)植物の生育と微生物 第2章植物の根に共生する微生物 p.41-74を若干訂正(博友社転載許可)>

生物的窒素固定についての英語版はこちら BNF.html

1  共生的窒素固定のあらまし

 

1.1.窒素固定と共生

空気中の窒素ガス(N2)を還元してアンモニアと水素ガスを作る生物反応は酵素ニトロゲナーゼで触媒される。この反応を窒素固定作用という。
ニトロゲナーゼの反応は次の化学式であらわされる。
N2 + 8RH = 2NH3 + H2 + 8R
(RHは還元性物質で,Rはそれが酸化されたもの)
この反応は微生物である原核生物と古細菌にのみ見られ,真核生物には無い.
固定したアンモニアを自分の窒素栄養に使う微生物を,独立性窒素固定菌という。
一方,なんらかの植物にかかえ込まれて,密接な関係を保ちつつ,固定したアンモニアを相手の植物である宿主に与えるものを共生的窒素固定菌という。
宿主は共生菌から窒素固定産物をもらうので,空中の窒素ガスを間接的に同化できる。 一部の共生的窒素固定菌は宿主を離れて,独立性窒素固定菌として生育できる。
共生的窒素固定を理解するために窒素固定のつぎの一般的性質を念頭に入れておく必要がある。 
i)窒素固定にエネルギーの供給が必要である。1分子の窒素ガスの還元には少なくとも16分子のATPが必要である,
ii)ニトロゲナーゼ活性が酸素ガスで容易に破壊されるので,好気性窒素固定菌はいろいろな方法で酸素ガスの害から守る機構を発達させている,
iii)窒素固定産物のアンモニアが供給されると,窒素固定菌は窒素固定をやめて,アンモニアを吸収するようになる。

1.2 共生の特徴と利点

生物間の共生とは生物どうしが密接に関係しあって生活していて,一方が他方をりょうがしてしまうことはない。
一般には相互に利益を分かちあう場合を共生としている。
共生的窒素固定では宿主は共生菌から窒素固定産物をもらい,そのかわり,共生菌にその活動のエネルギー源となる有機化合物を与える。
共生的窒素固定が活発に進行しているときには,菌は窒素固定でできたアンモニアの同化をせず,宿主に供給している。
共生の過程の特徴は宿主特異性と,相互の生物の成育の同調化であろう。
宿主特異性とは共生関係が限られた範囲の生物の間でのみ見られることをいう。あるグループの植物から分離された微生物がそのグループの植物に対して共通に共生できる場合,これらのグループの植物は同一の交互接種群に属するという。
相互の生物の成育の同調化とは両者の細胞の分裂がなんらかの機構で調節しあって,一方の増殖が他方の増殖に打ち勝ってしまうことはないことをいう。 
この調節は共生微生物を特異な組織ー共生組織ーに制限することで行われる。
共生的窒素固定菌はすべて好気性である。 好気性菌の酸素呼吸はエネルギー獲得の効率がよいので,消費したエネルギー源に対する窒素固定の効率は良くなる。しかし,一方では好気性菌のニトロゲナーゼは酸素ガスの害から守られなければならない。 
共生系では酸素ガスの害に対する特徴的な防御機構が発達している。
こうして,共生的窒素の効率(消費されたエネルギーに対する窒素固定量)は概して独立的窒素固定より高くなる。

1. 3 共生的窒素固定菌の種類とその宿主

窒素固定能を持つ微生物の属は100以上ある。
そのなかで共生的窒素固定能力のある菌がみられるものは真正細菌(バクテリア)では根粒菌(リゾビウムRhizobium )*,放線菌(アクチノミセテスまたはタロバクテリア)ではフランキア(Frankia)。
らん藻(シアノバクテリア)で緑色植物と共生するのはヘテロシストをつくるらん藻であるノストック(Nostoc)に限られている。
* 根粒菌は後述するようにリゾビウム(Rhizobium),ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium),アゾリゾビウム(Azorhizobium)の3属に分けられるけれど,はじめに名付けられたリゾビウムで3属を代表することがある.

これらの共生系を,共生微生物,植物宿主の範囲,共生微生物の存在でのみできる特異的共生組織の有無,細胞内共生の有無,酸素ガスに対する防御機構,共生菌の分離・培養と再接種の有無などで整理すると表1のようになる。


  表1  窒素固定微生物と緑色植物との共生


らん藻共生系がもっとも特異性が低く,分離されたらん藻は植物の網をまたがって,共生することができる。共生菌によって特殊な共生組織ができることはない。
ついでフランキア共生系(アクチノリゼ Actinorhizaeー共生)で,共生菌はいくつかの科の植物をまたがって,共生することができる。
根粒菌共生系がもっとも特異性が高い。

根粒と茎粒の写真へ

2 根粒菌とマメ科植物の共生

根粒菌とマメ科植物の共生関係は共生的窒素固定の中で、もっとも研究されてきた。

2.1 マメ科植物の根粒形成

なぜマメ科植物とは植物分類上かなり離れたニレ科のParasponiaにも根粒菌が根粒をつくるのか全くわからない。
マメ科LeguminoseaeはCaesalpinioideae Mimosoideae, Papilionoideaeの3亜科にわかれる。
Caesalpinioideaeeは主に熱帯に分布するもので、系統発生的にマメ科のなかでは古いとされている。
この科では調べられた内、約20%くらいしか、根粒をつくらない。根粒つくるのはこのうち,Chamecrista属に主にみられる。
Mimosoideaeと温帯で栽培されているもののほとんどが属するPapilionateaeでは80%以上の種が根粒をつくると報告されている。

2.2 根粒菌の性質

根粒菌の性質はかなり多様である。 以前は根粒菌はその形態,培養的性質とその宿主
(根粒をつくれる植物)の関係から分類されていたけれど、今日では根粒菌のDNAの類縁性から分類がおこなわれている。。
細菌分類の現代的方法である,系統発生を反映しているとされている16S rRNAまたはその遺伝子の塩基配列による分類に基づくと,根粒菌はProteobacteria a superfamilyに属し,
3つの属Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobiumにわかれる
(以前はすべての根粒菌はRhizobiumの属名が与えられていたので,根粒菌のことをrhizobiaということもある)
この3属は遺伝的にかなり離れている。 おもな特徴と近縁属は表2のとおりである。

表2  根粒菌の3大属とその特徴

1994年時点での種とその宿主を表3に示す。

表3 根粒菌の種とその主な宿主

1996年の段階ではRhizobiumはRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobiumの3属に細分され,新たに(Sino)Rhizobium saheli, (Sino)Rhizobium teranga, (Meso)Rhizobium ciceri, (Meso)Rhizobium tianshanense, (Meso)Rhizobium mediterraneum, Bradyrhizobium lianingenseが加わった。
今後,熱帯のマメ科植物から分離された菌の研究が進み,DNA分析が一般化すれば,種の数は増えていくものと思われる。

菌の種とその宿主には一定の関係があるけれど,宿主だけで菌の種は決められない。というのは菌の種と宿主のあいだの関係が不規則な例が沢山あるからである。
表3をみてもPhaseolus vulgaris(インゲン)にはいろいろな種類の根粒菌が根粒を作る。
Glycine max (栽培ダイズ)の根粒菌にはBradyrhizobiumの2種のほかにRhizobiumのR.frediiがある。
Parasponiaから分離されたNGR234菌は広い範囲のマメ科植物に根粒を作る。
多種類の熱帯マメ科植物の根粒から分離されるのはBradyrhizobiumの仲間で,きわめて多様性に富んでいるが,種として区別できる
(国際的規約ではDNAの相同性が70%以上のグループを種として区別する)ほど分化していないのであろう、まだ種として名がついていない。
熱帯アジアの栽培ダイズから分離される根粒菌には表3に示した2種のBradyrhizobiumとは明らかに区別できる第3のグループがあることが判ってきた。
種として特化したのは特異な環境条件や長い栽培のあいだに宿主と菌の人為あるいは自然淘汰が進んだ場合で,
宿主範囲が重複した遺伝的変異の幅がひろい未分化な菌のグループが自然には多いと考えたほうがよさそうである。 
菌が特異な宿主を,あるいは宿主が感染可能な菌を認識する分子機構とその遺伝学を述べたのちにふたたび宿主特異性と菌とマメ科植物の共進化の問題を論ずる事にしよう。

2.3 根粒菌の遺伝学

表2に示したように窒素固定や根粒形成に関する一連の遺伝子はRhizobiumではSymと呼ばれる大型の(100〜300kDa)プラスミドにのっている
(R. lotiのような例外はあるが)。その他の根粒菌では染色体に乗っている。根粒形成に関する遺伝子はnod およびnolと名付けられている。 
この遺伝子に欠損が生じれば,根粒形成が起きなかったり,著しく遅延したりする。 また宿主範囲が変わる事もある。 
窒素固定に関する遺伝子のうち,Klebsiella やAzotobacterのような独立窒素固定菌のnif遺伝子と相同なものはやはりnif遺伝子と名付けられている。 
nif遺伝子に欠損生じれば,根粒はできても窒素固定はできない。共生的窒素固定時のみ働く遺伝子はfixと名付けられている。 
fix遺伝子に欠損が生じても根粒菌が宿主を離れて,培地上で窒素固定するときには影響ない。
根粒菌は長い間,培地上で窒素固定できないとされていたが,今日では酸素ガス分圧を低くすれば,可能である。
とくにAzorhizobiumや 一部のBradyrhizobiumでは培地上での窒素固定は簡単である。
根粒形成と窒素固定が正常に起こるためにはこれらの3グループの遺伝子のみでなく,染色体やその他のプラスミドに乗っている,いくつかの遺伝子も必要である。
これらの遺伝子のうち細菌細胞の細胞外ポリサッカライド(Exopolysaccharide)に関係するexo遺伝子の変異は根粒形成の異常や宿主範囲の変化を引き起こす。
nod遺伝子群
nod A,B,Cは共通nod遺伝子で,どの根粒菌でも通用する(nod I,J,Mも共通のようだ)。
その他のnodE,F,G,H,L,P,Q S,U,Zなどは宿主によって特異な働きをするので,宿主特異nod遺伝子といわれる。
nol遺伝子もこのなかにはいる。
これらnod, nol遺伝子のはたらきは根粒菌と宿主の間の特異性を決める分子機構に関係するので,そこでくわしく述べる。
nif 遺伝子群
窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子窒素固定nif H,D,Kはいうまでもなく,制御遺伝子のnifAなどがある。 
独立生活型窒素固定菌で発見されているモリブデンをふくまないニトロゲナーゼ系の遺伝子vnf, anf はない。
fix遺伝子群
根粒組織内のnif 遺伝子の発現制御に関係する遺伝子fix J,K,L,
根粒中の根粒菌に特異な呼吸系酵素に関係する遺伝子 fixN, O,P,Q,などが知られている。

2.4 根粒形成過程

根粒の断面写真

根粒ができ,その組織体制が整い,根粒組織内に根粒菌がぎっしりつまり,バクテロイドという変形した形になり、
菌と植物をめぐる生理的条件が整ったときに、根粒菌の窒素固定能力が最高に発揮される。 この体制成立に必要な菌と植物の遺伝的性質はかなり解明されている。
 それを理解するために根粒形成の過程を簡単に述べる。
根粒は根にできるけれど,水生マメ科植物のSesbania, Aeschynomene, Neptunia属のある種では地上部の茎の表面にも”根粒”が形成される。このような場合,”茎粒”と呼んでいる。 
しかし,厳密にいうと茎粒は地上根にできた根粒である。地上根がわずかしか伸長しないので,肉眼でみるとあたかも茎の上にできたように見える。
ここではもっとも研究されている根に根粒ができる場合を述べる。

Step A 根の表面への集積と表皮細胞への付着

この過程では植物から分泌される物質によって菌が根の表面で増殖・集積する。
しかしあまり宿主特異性は発揮されない,非選択的なものである。 
菌の集積には走化性が関係することもある。菌と植物細胞の接触にはそれぞれによる特異的な化学認識が働くという説があるが,広くは支持されていない。

Step B 皮層細胞への侵入

 根粒菌の侵入のいろいろな方式は図7に模式的に示した。
侵入には3つの基本的型がある。
 1. 根毛の先端から侵入する:これは大部分のマメ科植物でみられ,もっとも研究されている(図7A)。 
感染は若い根毛で起こる。根毛の先端にくびれが見られるが,これは感染の結果というよりも菌のつくる物質による植物の反応のようだ。
 2. 分岐根が表皮をつきぬけることや傷でできる表皮細胞の間の割れ目から侵入する:
Sesbania rostrata(図7C)やラッカセイ(図7F)が代表的な例,茎粒はみなこの方式で侵入する。
Parasponia(図7E)の根粒でもこの方式。
 3. 根毛のない表皮細胞の接合点から侵入:マメ科樹木のMimosa scabrela(図7D)で見られる。

Step C 初期分裂細胞と感染糸の形成

根毛細胞に侵入した細菌は分裂しながら,根の内部に向かう。
厳密にいうと,菌の植物細胞への侵入は植物の細胞膜のくびれによって起こるので,細胞の外であるが,見たところ細胞内に侵入したように見えるので,普通細胞内への侵入という。
アミーバーが異物を取り込むのと同じ現象である。
侵入した細菌のまわりには植物のセルロース細胞壁由来のさやが出来る。
このさやを感染糸という。感染糸は皮層の細胞層を貫く。
感染糸の進行方向の先の皮層の外側の細胞が分裂を始める。 
これを初期分裂細胞という。この細胞分裂は今日では感染糸形成に先立つ変化だと考えられている。
根毛侵入でない上記の2つ型では細菌は植物細胞の間のすきまで分裂しながら皮層内部に達するので,細胞内の感染糸はできないか、できてもわずかである。
やはり菌の侵入にともなって皮層の細胞が分裂する。
 

2.5 根粒形成での宿主特異性を決める分子情報のやりとり

菌や植物にとって相手を認識する身分証明書は相手が出す特異な分子である。
遺伝子の発現条件を調べるのに,その遺伝子の代わりに,活性が簡単に測定あるいは確認できる酵素の遺伝子をDNAに入れてやれば,
目的の遺伝子が発現したときに,酵素活性が現れる。この酵素遺伝子が影武者として働いている事になる。このような遺伝子をレポーター遺伝子という。
この手法で根粒菌の根粒形成遺伝子nodの発現条件が調べられた。
その結果,宿主マメ科植物の根や種子の分泌物中にnod遺伝子を発現させる物質が含まれていることが判った。1982年頃である。
さらに研究を進めた結果,この物質はフラボノイドであることが判った(1986)。nod遺伝子は宿主からのフラボノイドで転写されるけれど,宿主以外のフラボノイドでは転写されないか,それが抑えられる。 
このフラボノイド化合物が菌の宿主範囲を決める植物から出る第一番目の化学シグナルである。

この菌のnod遺伝子を発現させる菌に特有なフラボノイイドの存在下で,菌を培養してnod遺伝子の産物をしらべた。
この産物は低分子の脂肪酸結合キチン(Lipooligochitin)で,宿主に根粒形成初期に植物に現れる形態的変化の一部(皮層細胞の分裂,根毛の先のくびれ,など)を引き起こす(1990)。 
Nod factor (根粒形成因子)といわれる。アルファルファはこのNod factorで処理されると,空の根粒をつくる。 
菌によってつくられるNod factorの構造はすこしづつちがう。 
また植物のほうも対応する菌のつくるNod factorにもっともよく反応する。表4にいろいろな菌のつくるNod factorの構造をしめす。

表4 いろいろな菌のつくるNod factorの構造

キチンの骨格についているいろいろな残基と糖の分子数が特異性を決めているようだ。
まず菌は宿主の出す特異的なフラボノイドに感じてnod遺伝子が発現され,
その産物である特異なNod factorが,対応する宿主に根粒形成の初期反応をひきおこす。
フラボノイドの特異性は低いので,もういちどNod factorでふるいをかけているといってよい。 
ダイズに根粒をつくるBradyrhizobium japonicumと Rhizobium frediiは分類上の位置はかなり離れているが,同じNod factorを作る。
いろいろな宿主に根粒つくる菌Rhizobium sp. NGRは何種類かのNod factorを作るし,
いろいろな菌で根粒のできるPhaseolus vulgarisはいろいろな種類のNod factorに感じる。
菌と宿主の間の特異性の問題の一部はこうして,特異的な分子シグナルの交換で説明つくようになった。
ただ根粒形成の特異性がすべて,この図式で説明されるわけではない。
菌の細胞外ポリサッカライドも一役はかっているし,Nod factorだけが根粒形成のために菌がつくる物質であろうはづがない。
Nod factorの合成、運搬にたいする菌のいろいろなnod遺伝子の役割もかなり解明されている。
まず構成的遺伝子であるnodDに対応する遺伝子の転写を制御するNodD蛋白が特異なフラボノイドを認識して,活性化(燐酸化)すると,
他の一連のnod遺伝子が転写される。
共通nod遺伝子のnodABCに対応する蛋白はLipooligochitinの骨格を作るのに関係し,宿主特異的nod遺伝子はNod factorの特異的な残基の(表4でQ,R1〜R5で示した)合成と結合に関係している。 
Nod factorにかかわる菌のほうの遺伝子の解明はかなり,進んでいるけれど,Nod factorに感じる植物のほうの機構はほとんど判っていない。
Nod factorがきわめて低濃度(10-11M)で,特異的に働くので,植物のほうに対応したNod factorの認識分子があるはづだが,まだわからない。

根粒形成初期での菌と植物の相互作用の模式図を図8にしめす。

根粒形成過程中での植物のほうの遺伝子の動員体制を研究するために, 根粒形成の過程で根粒に特異的に現れる蛋白(Nodlin蛋白という)とそれに対応するm RNA, DNAの解析が進んでいる。 
nodlin蛋白の遺伝子は50以上のものが報告され,それぞれの発現時期も推定されている。どの組織で発現されるかは,
それぞれのmRNAの発生を調べたり,nodlin蛋白の遺伝子DNAをレポーター遺伝子で置き換えた植物を用いたりして研究されている。
根粒形成のごく初期に現れるENOD12蛋白の遺伝子は対応する菌の接種後3時間で根粒形成のおこる根毛や表皮細胞で発現されてくる。
Nod factorを加えても,発現されるし,自動的にできるアルファルファの根粒や,根粒に似た構造をつくらせるホルモン処理でも現れる。 
これらのnodlin遺伝子の発現調節がどうやって行われるかを調べて,根粒形成で菌からのシグナルや植物からのシグナルがどう器官形成にかかわる遺伝子と蛋白の活動の順序を決めているかを解明しようとしている。
フラボノイドの分泌(植物)ーnod遺伝子発現によるNod factorの生成(菌)ーnodlin遺伝子の発現(植物)という図式ではなぜ多くの感染糸が途中で止まってしまい,侵入した菌の一部しか根粒組織に入れないかを説明することはできない。 
植物側に菌に対する抵抗反応が起こっているはずである。

2.6 窒素固定工場の運営

 

2.6.1 必要な設備

根粒菌の窒素固定は完成した根粒組織のなかでのみ進行する(ただしAzorhizobiumは根粒形成の初期でも窒素固定しながら増殖しているらしい)。
ニトロゲナーゼの量は根粒菌の蛋白の2割にも達する。
完成した根粒の模式図を図6にしめす。
Parasponiaの根粒では根のように維管束は中心にあり、バクテロイド組織はそのまわりにあり,Frankiaによる樹木の根粒にちかい。
中央には根粒菌が一杯つまった(10^11細胞/mL)植物細胞のある組織ーバクテロイド組織が存在している。
バクテロイド組織の写真
植物細胞中の菌はバクテロイドと呼ばれるように、変形し、一個から数個集まってperi-bacteria membrane(PMB)という植物由来の特殊な原形質膜でつつまれている(図7に示したすべての場合にそうなのかまだ不明)。
PBMと菌の間のすき間には根粒ヘモグロビン(leg-hemoglobinというけれど、これは窒素固定性放線菌が共生してできる根粒のなかにも含まれていることがあるので、いまではおかしな呼び名で、ここでは根粒ヘモグロビンと呼ぶ)が存在している。
この3者の複合体をsymbiosomeという。 PMBの上には菌と植物の間の物質のやりとりをつかさどる蛋白が乗っていると思われる。
地上部で作られた光合成産物の糖が根粒の外側を囲む維管束を通って根粒の植物細胞に送られる。糖は植物細胞で有機酸にかえられて、symbiosomeに入る。
菌はこの有機酸を酸化してATPと還元剤をつくり、これが菌のニトロゲナーゼ活性を支える。ニトロゲナーゼでできたアンモニアは植物の細胞で主にグルタミンに取り込まれる。
グルタミンはさらにアスパラギンなどのアミノ酸(エンドウ、アルファルファなど)か、ウレイド化合物ーアラントイン、アラントイン酸(ダイズ、インゲンなど)になって地上部に送り返される。
ウレイド化合物は窒素固定の特有な産物なので、これらの化合物の量で窒素固定量を推定できる。
ウレイド化合物はアミノ酸から尿酸までの合成は菌のいる感染細胞でおこなわれ、尿酸からアラントイン、アラントイン酸の経路は感染細胞のとなりの菌のいない細胞でおこなわれるとされている。
根粒中の諸反応に必要な植物側の酵素や蛋白質は多く根粒特有なNodlin蛋白である。
その発現にはおそらく菌からのシグナルが必要であろう。 根粒ヘモグロビンではこのことが確かめられている。

2.6.2  窒素固定の制御 とくに酸素ガスの供給をめぐって

ニトロゲナーゼは酸素ガスで容易に活性を失う。
一方ニトロゲナーゼの活性にはATPを必要とし、このATPは酸素呼吸で能率よく生産される。 ニトロゲナーゼを生物にたとえるならば、酸素ガスは嫌いだが、エネルギーをかせいでくれるので必要であるという矛盾に遭遇することになる。
好気性窒素固定菌はこの矛盾をいろいろな戦術で解決している。とくに共生的窒素固定ではこの戦術は実に巧妙である。
根粒中の根粒菌はまず根粒ヘモグロビンから常時低濃度の酸素ガスの供給をうけている。
根粒ヘモグロビンの酸素親和度は極めて高く、遊離酸素ガスが50nM(空気の酸素ガス濃度の1/5000で平衡)で半分が酸素ガスと結合した形となる。 このため根粒中の遊離酸素ガス濃度は10nMくらいである。
一方、バクテロイド組織内の根粒ヘモグロビン濃度3mMは2気圧の酸素ガスと平衡している酸素ガスを蓄えていることになる。 
根粒ヘモグロビンは菌の回りの酸素ガス濃度を下げながら、円滑に供給する働きをしている。 菌の回りの酸素ガス濃度がこんなに低ければ、これを利用する菌の末端酸化酵素ーシトクローム酸化酵素もきわめて酸素親和性の高いものでなければいけない。
 このシトクローム酸化酵素の性質はまだ充分解明されていないが、fix N,O,P,Q遺伝子によって決められるcbb型の鉄ー銅酵素であろう。
根粒菌はAzorhizobiumとAeschynomeneの茎粒のBradyrhizobiumを除いて、
培養器上ではなかなか窒素固定はできず、根粒中で活発に窒素固定をする。
根粒中のバクテロイドでニトロゲナーゼが活性化する機構もわかってきた。
鍵はやはり酸素ガスであった。独立生活窒素固定菌のニトロゲナーゼ遺伝子の発現は低アンモニア濃度で起こり,高アンモニア濃度で抑えられるけれど、
根粒組織中の根粒菌ではアンモニアよりも、酸素ガスがニトロゲナーゼ遺伝子の発現制御条件である。
根粒菌は共生状態ではアンモニアを細胞外に出しているので、アンモニアでニトロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制されないようになっていると考えられる。 
低酸素ガス条件を菌の膜の上にあるFix L 蛋白が感知すると、Fix J蛋白を活性化(燐酸化)する。 これはさらに Fix K蛋白を通じてニトロゲナーゼ遺伝子の読みとりを開始させるNifA蛋白のnifA遺伝子を発現させる。
 BradyrhizobiumではNifA蛋白が直接低酸素ガス条件で活性化するらしい。
根粒菌は低酸素ガス条件を維持できれば、根粒外で窒素固定はやれる。
このときはアンモニアによる制御が行われ、低アンモニア条件の感知蛋白であるNtrCが働いて、nifA遺伝子の転写をさせる。
(培地上で簡単に窒素固定できる,独立窒素固定細菌の性質を強くもっているAzorhizobiumは根粒中でもNtrC(独立窒素固定菌でアンモニアを感知してその情報をnifAに与える制御蛋白)の制御を受けている。
バクテロイドに特有なFixK蛋白はニトロゲナーゼの合成のみでなく、バクテロイドで窒素固定が円滑にすすむための蛋白例えば、酸素ガス親和性の高いシトクローム酸化酵素の発現のGOシグナルをだすこともやっている。
またNifA蛋白もニトロゲナーゼの合成以外に根粒の機能に関係する蛋白の遺伝子の読みとりを調節しているらしい。
根粒を空気の酸素ガス濃度より高いところにおくと一時的に窒素固定活性が低下するが、すぐに復活する。
高酸素ガス条件では根粒の皮層に酸素ガスの拡散をさまたげる障壁(実体は不明)ができるらしい。
ともかく共生窒素固定では、いろいろな方法で酸素ガスの害を防いでいる。

2.7 土壌中での生態

2.7.1 土壌中の生活

根粒中の根粒菌は根粒崩壊後土にもどる。土壌中では腐生的生活(土壌や植物から供給される有機物を酸化しての生活)をしていると思われている。 
宿主作物を一作作ると、土壌中の根粒菌数はグラム当たり105〜106に達するが、宿主の栽培をやめると、徐々に菌数が減る(大体1年で一桁さがるくらい)。
減り方は土壌条件によるけれど、その間、土壌中で休眠しているわけではない。
新鮮有機物を消費して生育はできる。
菌数がグラム当たり102くらいなら、特に新しく接種しなくても、根粒を作ることができる。 
その理由は根粒菌が宿主の根圏で増殖できるからである。宿主の根から出る糖、アミノ酸,ビタミンなどの影響である。
nod遺伝子を活性化させるフラボノイドの一部やアミン(ベタイン,トリゴニン,スタチドリンなど)は根粒菌の走化性の誘因や生育促進物質になる。 しかしこれらの物質は特異的ではない。
根粒菌は宿主植物ばかりでなく、他のマメ科植物やその他の植物の根圏でも増殖する。
一般に根圏で増殖して、植物の生育を促進したり、土壌伝染病原菌に対抗してりする能力のある細菌を植物生育促進根圏細菌(Plant Growth Promoting Rhizosphere Bacteria-PGPR)と呼んでいる。 
よく知られているのは蛍光性シュドモーナスである。
根粒菌もPGPRと考えられ、その宿主以外の作物に接種しても、作物の生育を促すことがある。ときには根粒菌は蛍光性シュドモーナスよりもまさった増殖をしめす。
 PGPRが植物の成長をうながすのは、ホルモン生成、鉄に親和性の高い物質siderophoreの生成、抗菌性物質の生成などの機構によるとされているけれど、根粒菌もすべてではないにしても、こういう働きをしめす。 
茎粒をつくるAzorhizobiumやAeschynomeneのBradyrhizobiumは葉の表面(phyllosphere)でも生育できる。
根粒菌には生育の速いRhizobiumと遅い Bradyrhizobiumがあるが、この培地上の生育速度の差が土壌中で現れるかわからない。 
しかしBradyrhizobiumはその生育に必要な炭素濃度からすれば低栄養細菌とみられる。 
B. japonicumのうち吸収型ヒドロゲナーゼのあるものは水素ガスと二酸化炭素で生育できる。 
水田条件では吸収型ヒドロゲナーゼのあるBradyrhizobiumは、ないものより長く生存できる。水田で発生する水素ガスが菌の生育を支えているものと思われる。
根粒菌の遺伝生態もすこしづつ、わかってきている。 
同じ圃場、あるいは同一の植物から分離した根粒菌のあいだに遺伝的変異があることがしばしばある。 これはアイソザイム(酵素多型)、DNAのfingerprintingなどで検出されている。
根粒菌のなかにはDNAに反復配列をもったものがある。この反復配列をもったDNAの断片の長さやその塩基配列は非常に変異しているので、菌株の識別につかえる。
この手法でBradyrhizobiumの多様性が調べられている。不思議なことに、ある圃場ではこの反復配列のコピー数の非常に多い場合(超反復配列現象)が見つかっている。
どうして特定の圃場であらわれるかわからないけれど、反復配列ではさまれた部分が”動く遺伝子”である可能性は否定できない。
アイソザイム(酵素多型)の分析からも近い位置に存在した菌の間で頻度は低いものの遺伝的混合がおこっているらしいことが推定されている。
土壌中の菌で遺伝子伝達の機構は判らないけれど、どうも起こっているらしい。
ニュージーランドにはLotus(ミヤコグサ)は自生していなかったので、その根粒菌R. lotiは存在しなかった。
従って当初は菌の導入が必要だったが、7年後Lotusの根粒から分離した根粒菌にはもとの接種菌もいたけれど、遺伝的にそれとちがうもの、なかでも染色体の16s rRNA遺伝子が導入したものと違うものが見つかったという。
導入した菌と染色体がちがうものにはR. lotiの根粒形成ー窒素固定遺伝子が認められたので、土着の菌に遺伝子が伝達した結果ではないかと考えられる。 
最近、この根粒形成遺伝子の水平伝達部分の遺伝子構成がわかった。 
系統進化的にかなり離れたBradyrhizobium japonicumとRhizobium frediiにダイズに根粒をつくるnod遺伝子が存在し,Nod Factorも似ていることは、かって水平伝達がおこったためではないかと疑わせるけれども、現代でも遺伝子の水平伝達がおこっているとすれば、面白い。
土壌中の根粒菌の遺伝生態を研究するときに一番問題となるのは根粒から菌を分離することで、大きな選択がされてしまうことである。 
土壌から根粒を通さずに、根粒菌を分離できないものだろうか? 
これはすでに何人かの研究者で達成されている。 まず適当な培養基でそれらしきものを拾い、根粒菌種に特異な16s rRNA遺伝子で確認する。 
こういう実験の結果、土壌中には根粒形成能力のない”根粒菌”がたくさんいることが判った。
インゲン菌R. leguminosarum bv. phaseoliではインゲンの根圏から分離したこの菌の2.. 5%しか根粒形成遺伝子をもっていなかった。
R. leguminosarumではSymプラスミドがあるので、根粒形成ができなかった菌にSymプラスミドを移してやると、根粒形成能力は回復した。 
クローバ根粒菌の全DNAとの相同性の高いかどうかで、土壌のグラム陰性細菌をよりわけ、このなかでは3%の菌がクローバに根粒を作った。
やはり根粒を作らなかったものにクローバ根粒菌のnod遺伝子をふくむプラスミドを入れたら根粒つくるようになった。 
このように土壌中には根粒形成能力のない根粒菌が存在していると考えてよい。
 遺伝子の相同性で検出することで、はじめて 根粒形成能力のない根粒菌が確認できるようになった。 
また, 土壌から分離した根粒菌と根粒から分離したものとが,遺伝的に異なっているという証拠もある。
これからは土壌中での根粒菌の共生遺伝子の獲得、損失や根粒を通さずに分離した根粒菌の遺伝生態の研究が必要であろう。

2.6.2 根粒菌の接種と競合的根粒形成

土壌中に根粒菌がいないときはいうまでもなく,すでにいるときでも優良根粒菌の接種がおこなわれる。 
通常種子に接種する。土着の菌の菌数が充分高くても,その菌の共生的窒素固定能力が低い場合,共生的窒素固定能力の高い菌を接種してマメ科植物の生育を増大させる試みが行われる。この場合,接種菌は土着菌との競争して,高い頻度で根粒を形成しなければならない。 接種菌の菌数を通常の場合より,増やせば,根粒形成割合(できた根粒中で接種菌のしめる割合)も増やせる。 
根粒形成をめぐっての根粒菌間の競合は根圏での増殖での競合,根粒形成の速さでの競合(一度できた根粒は近傍での根粒の形成を抑える傾向があるので,速くできるほうが有利),根粒の近傍根粒の抑止能力などいろいろな条件で支配される。
その遺伝的解明もほとんどされていない。 
接種菌を根粒中で優先させる方法として土着の根粒菌にはほとんど親和性を示さない植物の系統を育種することが考えられている。


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文献解題
窒素固定と根粒菌について
日本語
総説
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